产品介绍：

2×Seamless Cloning Mix是一款简单、快速、高效的无缝克隆试剂，可以将插入片段定向克隆至任意载体的任意位点，一次实现多至 5 个插入片段的特定顺序组装克隆，无需考虑插入片段自身携带的酶切位点。在克隆前，需要先将载体进行线性化，并在插入片段正反向 PCR 引物引入线性化载体末端序列，使得 PCR 产物 5‘和 3’末端分别带有和线性化载体两端一致的同源序列（15-25 bp）。这种带有载体末端同源序列的 PCR 产物和线性化载体以一定比例混合，在重组酶的作用下，50℃反应 15-60 min 即可以完成重组。

本试剂为 2X 预混液形式，包含优化的反应缓冲液和增强的酶混合物，可显著提高片段的组装效率与对杂质的耐受度，无缝组装后的产物是完全封闭的双链 DNA，可直接用于下一步 PCR、RCA 或其它分子生物学操作（例如转化到感受态细胞）。

产品特点：

1.简单、快速、精确、定向克隆，连接过程只需要15分钟。

2.只需要简单的PCR扩增就可以制备目的片段，不需要内切酶、连接酶和磷酸化酶。

3.线性化载体的制备可以通过PCR扩增或选择合适的内切酶酶切。

4.可以克隆长片段DNA。

5.高效率，阳性克隆率高

实验原理：    

保存条件及效期：-20℃保存两年。

操作步骤：

1.线性化载体的制备

（1）酶切制备线性化载体

利用单酶切或双酶切对克隆载体进行线性化处理，一般双酶切比单酶切线性化效果好。载体的完全线性化是无缝连接成功的关键。不完全酶切的载体的重组产物经转化后出现的假阳性克隆一般是由未线性化的环状载体转化而形成的。当假阳性克隆较高时，需要重新酶切载体。电泳方法判定载体线性化是否完全时，一定要用未酶切的质粒做对照一起电泳。

在质粒载体上选择的重组区域应为无重复序列且碱基分布均匀的区域。重组区域内G+C%含量在40%～60%范围之间，重组效率将达到最高。单酶切或双酶切方式制备的线性化载体无需进行末端脱磷酸化处理。

（2）反向PCR扩增制备线性化克隆载体

以载体质粒DNA为模板，克隆位点为分界点，设计一对反向引物用高保真DNA聚合酶扩增，制备用于重组的线性化载体。为防止残留环状载体质粒模板对克隆阳性率的影响。需要采用胶回收方法或者Dpn I消化结合胶回收的方法纯化线性化载体。高保真PCR扩增产物为平末端，DNA末端的功能基团为羟基，无磷酸基团（磷酸化修饰的引物除外）。

2.目的DNA的PCR扩增

插入片段可用任意PCR酶 (Taq酶或高保真酶) 扩增，无需考虑产物末端有无A尾 (重组过程中将被去除，在最终质粒中不会出现)。建议使用高保真聚合酶进行扩增以减少扩增突变的发生。PCR结束后，取少量产物进行琼脂糖电泳以检验扩增产物长度和特异性。非特异性扩增和引物二聚体的存在会严重影响克隆效率，建议用胶回收试剂盒纯化目的片段。

（1）单一片段的拼接克隆的引物设计

该试剂盒可以克隆任何PCR扩增产物，但是扩增引物有特殊的设计要求。引物序列包括5’端15-25nt的用于同源重组的重叠区域和3’端的目的基因的特异性引物组成。下图为单个片段克隆时的引物设计要求示意图。例如，BamH I，EcoR V和Kpn I酶切位点酶切后分别产生5’突出末端，平末端和3’突出末端。重叠区碱基长度设计在15-25nt之间，基因特异性引物紧挨着重叠区序列，长度通常为18-25nt。按照下图这种设计方法，制备重组载体时使用的内切酶的酶切位点将不存在。如扩增目的片段的引物中保留了酶切位点或额外添加了新的酶切位点，那么原始的酶切位点或新添加的酶切位点将出现在最终的重组质粒序列中。下图仅显示了单酶切的状况，实际操作中可为三种末端结构的其中一种或任意两种组合。

(2) 多个片段的组装克隆的引物设计

多片段组装克隆的引物设计见下图。载体两端引物设计方法同单一片段引物设计方法，多片段引物设计参照重叠延伸PCR引物设计原则。

推荐使用NEB公司的免费在线设计工具NEBuilder™，可进行多片段组装的实验设计。

3.载体片段的重组连接

按下表，在一个0.2ml PCR管中依次加入

操作：轻轻混合，离心数秒。在PCR仪上50℃保温15分钟。反应结束后，将离心管置于冰上用于转化实验。 若暂时不做转化实验，可将连接产物-20℃冻存。

注意：1.载体用量一般在50-100ng较好。载体和片段的摩尔比为1:1至1:3。片段小于200bp时，片段用量可增加到载体的5倍量。

2.50℃反应时间不要超过60分钟。

4.转化

（1）取连接产物加入到刚刚融化的感受态细胞中，轻轻混匀，冰水浴20-30分钟。

（2）42℃水浴热击90秒钟，切勿晃动水面。热击结束后立即置于冰水浴中保持2分钟。

（3）往管中加500ml的SOC或LB培养基，放入37℃摇床中200rpm左右培养60分钟。

（4）4000rpm离心1分钟，弃掉部分上清，保留100-200ml，用吸头轻轻吹打菌块重悬细菌，取一半菌液涂布于含抗生素的LB固体培养平板上，待液体吸干后，倒置平板，37℃培养过夜。

备注：若感受态使用方法不同，请按照感受态细胞产品说明书进行操作。

5.阳性克隆鉴定：

（1）菌落PCR方法；

（2）限制性酶切分析方法；

（3）DNA测序分析方法。